Então, estamos todos querendo entender o que fizemos estas duas semanas e fazer nossos relatórios. Vamos compartilhar nossas informações. Sugiro que usemos o blog para dados e o e-mail para fotos (aliás, alguém sabe onde estão o resto das fotos? (do Northern?)).
Postem os dados do seus grupos, os admins do blog podem ir complementando os posts conforme forem aparecendo os comentários
Vou começar colocando o que entendi dos experimentos, para termos uma visão mais global do que fizemos. Por favor comentem e complementem, tudo que estiver escrito aqui está sujeito a equívocos:
Objetivo geral: Verificar a existência e caracterizar o gene de fosfatidilserina sintetase II (de fosfatidiletanolamina) em
Crithidia fasciculata (procurá-lo, sequenciá-lo, ver sua expressão) e compará-lo aos gene correspondente de
Leishmania amazonensis e de outros tripanossomatídeos.
Experimento I: Extração de DNA.Objetivo: Aprender a extrair DNA.
Procedimento: Extração de DNA de
Crithidia fasciculata e quantificação.
Esta extração foi utilizada no Southern blot do grupo C.Protocolos: 1
Experimento II: Extração de RNA e Northern Blot.Objetivo: Procurar por bandas de RNA em
Crithidia fasciculata que hibridem,
sejam semelhantes ao RNA de fosfatidilserina sintetase II de
Leishmania amazonensis (conhecidos).
Procedimento: Extração de RNA de
Crithidia fasciculata, quantificação e northern blot.
Protocolos: 2A, 2B.
Experimento III parte 1: Identificação de sequências candidatas em tripanossomatídeos para posterior sequenciamento.Objetivos: Obter fragmentos de DNA de tripanossomatídeos semelhantes aos de
Leishmania spp, usando como primers fragmentos de seqüências de fosfadidilserina sintetase II de
Leishmania major conservadas evolutivamente.
Procedimento: Extração de DNA de tripanossomatídeos por centrifugação (feito pelos monitores), PCR do DNA de tripanossomatídios (2 por grupo) usando primers de
Leishmania major em várias temperaturas, eletroforese do resultado de PCR, nova eletroforese com as bandas mais fortes (indicando melhor temperatura), recorte do gel das bandas encontradas, purificação do DNA de cada banda.
Protocolos: 4A, 4B, 4C (o segundo protocolo número 3).
Experimento III parte 2: Transformação de bactérias E. coli usando plasmídios pGEM-T easy (que contém genes de Beta-galactosidase e de resistência a ampicilina).Objetivos: Implantar as seqüências selecionadas em
E. Coli para que se obtenha uma grande quantidade delas.
Procedimento: Reação de ligação entre plasmídio e DNA inserto (selecionado das bandas) na proporção 1:3.
Preparação das bactérias competentes(E. Coli) lavando-as com água fria para tirar os sais. Choque elétrico para desestabilizar a membrana (para a membrana ficar mais flexível e abrir mais poros virtuais). Implantação dos plasmídios nas bactérias (transformação), esperar 1h para estabilização e expressão do gene de resistência, implantação das
E. coli nas placas de Petri
com ampicilina, x-galactose e IPTG (induz expressão do gene de beta-galactosidase).
Protocolos: 3A, 3B, 3C, 3D.
Experimento III parte 3: Extração dos Plasmídios e Eletroforese.Objetivos: Extrair os plasmídios das bactérias transformadas para o sequenciamento.
Procedimento: extração do DNA das bactérias brancas (com o gene de beta-galactosidase interrompido), tempo para crescer, isolamento do DNA plasmídico (ele se reassocia mais rápido que o DNA genômico). Tratamento de uma parte dos plasmídios com EcoRI (separação do inserto e plasmídios), eletroforese.
Protocolos: 5, 6A, 6B.
Experimento III parte 4: Sequenciamento do DNA do inserto.Objetivos: Sequenciar o DNA do plasmídio e procurar sua seqüência no no BLAST (para verificar qual gene isolamos).
Procedimento: PCR assimétrico (isto é, com apenas um primer) com
deoxinucleotídios (nts normais) e dideoxinucleotídios (nts modificados), sequenciador e procura de sequências semelhantes no BLAST.
Protocolos: 7.
Experimento IV: Southern Blot do DNa genômico de vários tripanossomatídeos.
Objetivos: Verificar a existência possíveis seqüências semelhantes ao gene de fosfatidilserina sintetase II de
Leishmania amazonensis no DNA genômico de vários tripanossomatídeos.
Procedimento: (Extração do DNA genômico? Lise com TES?), Preparação de soluções com HindIII, PstI e ambos, marcação da sonda com fósforo 32 usando ATP modificado no fosfato alfa, eletroforese, tranferência para a membrana (hibridação) e lavagem da membrana.
Protocolos: 6A, 6B, 6C e 8.
Experimento V: Cinética enzimáticaObjetivos: Verificar a atividade de fosfatidilserina sintetase
I e II em
Crithidia fasciculata.
Procedimento: Lise de células de
Crithidia fasciculata usando sonicador, mistura em solução com serina marcada com trítio, adição de diferentes precursores (um fosfolipídio por grupo e um controle), interrupção da atividade de fosfatidilserina sintetase II, após 0h, 4h, 8h, 24h. Separação e descarte da fase polar (contendo a serina livre). Medição no cintilador da quantidade de radiação. Plotagem da quantidade de fosfatidilserina produzida presumida pela quantidade de radiação em cada tempo.
Protocolos: "9" (Ensaio de atividade de fosfafidilserina sintetase)